Vsebina
- Natrij kot detergent
- Natrij kot alkalno sredstvo
- Vloga natrijevega acetata
- Vloga natrija pri obarjanju DNA
- Natrij kot del puferske raztopine
DNK ne plava prosto znotraj celičnega jedra. Povezan je s številnimi različnimi beljakovinami in ujet v celično membrano. V živalskih celicah DNK vsebuje tudi jedrska membrana. Za ekstrakcijo DNK iz celice je treba najprej odstraniti membrane in z njimi povezane beljakovine, nato pa jih fizično ločiti od DNK. Natrij je lahko vključen v več korakov za dosego tega cilja.
Natrij kot detergent
Natrij je element. Njegov kemični simbol je Na, iz Natrija, latinske besede za natrij. Je pozitiven ion in se pogosto poveže z negativnimi ioni, da tvori koristne spojine. Na primer, ko so natrijevi ioni vezani na klorove ione, tvorijo spojino natrijev klorid, ki je običajna kuhinjska sol.
Pri ekstrakciji DNA se uporablja več različnih oblik natrija. Natrijev dodecil sulfat ali SDS (iz angleščine "natrijev dodecil sulfat") je detergent, ki vsebuje natrij. Ima kemično formulo C12H25NaO4S, v kateri Na simbolizira natrij. Detergenti se uporabljajo za razbijanje celičnih sten in membran. Delujejo kemično tako, da odpirajo luknje v membranah ali celičnih stenah.
Ko se luknje v membranah odprejo, jih je mogoče mehansko uničiti, kot pri mešalniku. Po tem je lažje vzeti vsebino celice, vključno z DNK.
Natrij kot alkalno sredstvo
Natrijev hidroksid je še ena spojina, ki vsebuje natrij in se uporablja za ekstrakcijo celične DNA. Kemična formula natrijevega hidroksida je NaOH. Ta spojina je osnova. Raztopina natrijevega hidroksida je zelo bazična ali alkalna. Natrijev hidroksid lahko deluje tako, da razrahlja togo strukturo celične stene ali membrane in s tem sprosti DNA.
Natrijev hidroksid se najpogosteje uporablja za ekstrakcijo plazmidne DNA. DNA plazmidov v bakterijah je v citoplazmi običajno v obliki obroča, ločena od kromosomske DNA v jedru. Medtem ko kromosomska DNA programira bakterijske celične funkcije in procese, je plazmidna DNA pogosto gensko spremenjena DNA, ki kodira določen gen ali gene, ki nas zanimajo. Plazmidi so zelo dragoceno raziskovalno orodje in njihovo pridobivanje bakterijskih celic je rutinski postopek v laboratorijih.
Za ločevanje kromosomske DNA in bakterijske fragmentirane DNA od plazmidne DNA se pogosto uporablja natrijev hidroksid. Kromosomska in fragmentirana DNA sta linearni, plazmidna DNA pa krožna. Ko je raztopina bazična - na primer, ko dodamo natrijev hidroksid - se dvojno verižne molekule DNA ločijo. To je znano kot denaturacija. Njihove komplementarne osnove niso več povezane med seboj. Lahko si ga predstavljate kot dve komplementarni strani zadrge. Ko je DNA dvoverižna, je zadrga zaprta. Ko je DNA denaturirana, zadrga ni samo odprta, ampak sta obe niti popolnoma ločeni drug od drugega, kot v suknjiču.
Po drugi strani pa molekule plazmidne DNA, čeprav v odprti zadrgi, niso ločene. Krožni trakovi zlahka najdejo svoje komplementarne baze in se "renaturirajo" nazaj v krožno dvoverižno molekulo DNA plazmida, ko raztopina ni več alkalna. To je ena od edinstvenih lastnosti plazmidov, ki omogočajo njihovo ločitev od kromosomske DNA. Na ta način lahko odstranimo plazmidno DNA z želenim genom, ki nas zanima, in ločimo od normalne kromosomske DNA bakterije.
Vloga natrijevega acetata
Natrij je lahko tudi v obliki natrijevega acetata. Tako kot natrijev hidroksid se tudi natrijev acetat pomaga ločevati plazmidno DNA od kromosomske DNA, vendar z zelo drugačnim mehanizmom in ob drugačnem času kot postopek ekstrakcije DNA.
Edinstvene verige linearne DNA niso topne v solnih raztopinah. Precipitirajo in tvorijo trdno snov.Če dodamo natrijev acetat raztopinam detergentov SDS, nastanejo trdne snovi celičnih ostankov in denaturirana kromosomska linearna DNA. Krožna plazmidna DNA ni topna v solnih raztopinah. Ostane v raztopini in loči želeno plazmidno DNA od preostale DNA v celici.
Natrijev hidroksid je osnovna rešitev za denaturacijo in ločevanje verig DNA, tako plazmidnih kot kromosomskih. Ko DNA ni več v alkalni raztopini, se lahko znova zbere le plazmidna DNA. Za ločevanje denaturirane in "odprte" kromosomske DNA od renaturirane in "zaprte" plazmidne DNA se z natrijevim acetatom selektivno obori kromosomska DNA in drugi celični ostanki iz dvoverižne plazmidne DNA.
Vloga natrija pri obarjanju DNA
Oborjeno kromosomsko DNA in celične ostanke je mogoče odstraniti iz topne plazmidne DNA, ki je še vedno v raztopini, s centrifugiranjem, hitrim postopkom predenja, zaradi katerega se trdne snovi vržejo na dno cevi v obliki majhne tablete. , ki omogoča ločevanje tekočine na vrhu, ki vsebuje plazmidno DNA.
To plazmidno DNA lahko nato oborimo z dodajanjem alkohola in soli v raztopino. Pogosto je zaželeno, da oborimo plazmidno DNA, da koncentriramo njeno količino v raztopini in jo vrnemo v raztopino, ki pomaga stabilizirati njeno kemijsko strukturo. Sol, ki se uporablja za obarjanje plazmidne DNA, je lahko na primer natrijev klorid ali natrijev acetat, lahko pa je tudi amonijev acetat ali litijev klorid.
Natrij je pozitivno nabit ion. V raztopini natrijevega klorida - na primer namizne soli - se molekula natrijevega klorida loči na natrijeve ione in kloridne ione. DNA pa je zelo negativno nabita. Visok negativni naboj molekule DNA nevtralizirajo pozitivni natrijevi ioni v raztopini. Ta nevtralizacija omogoča, da se DNA obori v alkoholu. Brez soli DNA ostane negativno nabita in ostane v vodnem delu raztopine.
Če to zmes centrifugiramo, se oborjena plazmidna DNA spremeni v peleto na dnu epruvete. Tekoči del je mogoče odstraniti in DNK nato vrniti v raztopino ali resuspendirati v drugi raztopini v želeni koncentraciji.
Natrij kot del puferske raztopine
DNA se navadno resuspendira v raztopini, ki vsebuje Tris in EDTA. To se imenuje puferska raztopina. EDTA (etilendiamin tetraocetna kislina) je kemična snov etilendiamin tetraocetna kislina, ki v laboratoriju običajno obstaja kot dinatrijeva sol, Na2C10H16N2O8. Puferske raztopine se uporabljajo za preprečevanje drastičnih sprememb pH; v tem primeru Tris / EDTA hrani DNA v raztopini s pH med 7,0 in 9,0.
