Vsebina

• Navodila
• Kaj potrebujete

Kloniranje DNK ali tehnologija rekombinantne DNA je orodje molekularne biologije, v katerem se izolira gen, ki nas zanima (ciljni gen), in prenese v samoreplicirajoč organizem, kot so plazmidne bakterije. Genetska koda bakterijskega plazmida se bo ponovila in ustvarila več kopij želenega gena v količinah, ki so zadostne za manipulacijo in analizo v znanstvene namene. Kloniranje gena se lahko izvede z uporabo plazmidov in restrikcijskih encimov, ki bodo razrezali DNA na koncih ciljnega gena ali pa z izvajanjem testa, imenovanega "verižna reakcija polimeraze" (PCR). polimerazna verižna reakcija '), ki bo ojačala želeni gen.

Navodila

PCR kloniranje lahko vključuje rast bakterijskih kultur, ki vsebujejo zahtevani gen (Slika bakterijskih kolonij po ggw iz Fotolia.com)

1. Preučite in se seznanite s tehniko PCR in protokoli kloniranja. V znanstvenem okolju je že veliko znanih informacij o molekularni biologiji, ki bi jih morali razumeti, če želite uspeti pri kloniranju. Številni protokoli in klonirni kompleti so komercialno dostopni od podjetij, kot so Qiagen, Invitrogen, Promega, Applied Biosystems in drugi. Zato določite, kaj potrebujete za vaše kloniranje in izberite ustrezne materiale in vire.

2. Izvedite reakcijo PCR na vaš zanimiv gen. Proces PCR vključuje cikle ogrevanja in hlajenja za denaturacijo dvoverižne DNA, hibridizacijo (ali žarjenje) majhnih fragmentov DNA, ki se imenujejo praški, za označevanje koncev zadevnega gena in konstruiranje novih komplementarnih pramenov. DNA z uporabo encima, imenovanega DNA polimeraza. Ti koraki se ponavljajo od 40 do 50-krat, kar ojača njihovo DNA iz vsakega cikla, kar povzroči na tisoče kopij ciljnega gena. Vedeti morate zaporedje genov, tako da uporabite ustrezne primerje, da obstaja naključna povezava med iniciatorjem in želeno regijo kode, ki jo želite razširiti.Glede na vašo metodo kloniranja - nenadne omejitve pri dokončanju določenih genov (topi konec) ali TA kloniranje (vključuje povezave s komplementarnimi timini, ki so zasnovani za lažje rezanje), lahko obstaja potreba po posebnih DNA polimeraznih encimih. , kot je Taq polimeraza, polimeraza, ki je razumno termostabilna pri visokih temperaturah, vendar nima nukleotidne korekcijske sposobnosti, in s tem skozi celotno konstrukcijo novih DNK verig Taq zaporedno ojača DNA in ostane kohezivna ojačanje.

   
   

3. Po želji je treba pomnožene gene očistiti v PCR. Ta korak se lahko izvede na več načinov. Eden od možnih načinov je filtriranje skozi kolone za predenje, da se odstranijo vsi preostali začetki ali encimi. Alternativno lahko elektroforezo izvedemo tako, da ločimo, odrežemo in speremo dobljene DNK pasove.

4. Povežemo prečiščeni gen in ustrezno pomnožimo s PCR plazmidnim vektorjem. V komercialno kupljenem kompletu bo zagotovljen standardni plazmidni vektor, kot je pGEM ali pCR2.1. Nastavite vašo vezavno reakcijo v skladu s proizvajalčevim kompletom ali priporočila za zahtevano količino pomnožene DNA, veznega pufra, plazmida in encima DNA ligaze. Zavezujoča reakcija bo omogočila krožnemu plazmidu, da vpelje svoj gen v plazmidni genom.

5. Izvedite reakcijo transformacije, v kateri je plazmidni vektor (ki vsebuje njegov gen) vstavljen v bakterijsko celico, pogosto z uporabo E. coli. Nekaj ​​dni pred pripravo tega koraka pripravimo agar plošče in plošče obdržimo v inkubatorju. Plazmid z celicami previdno združite z dodajanjem volumnov reagenta in z uporabo inkubacijskih časov, navedenih v protokolu, ki ga uporabljate. Bakterijske celice porazdelite na agar plošče, inkubirajte pri 37 stopinjah in jih pustite čez noč.

   
   

6. Na ploščah z agarjem opazite kolonije modrih in belih bakterij. Kolonije, ki vsebujejo vstavljeni gen, bodo bele, ne modre. Izberemo več belih kolonij in jih kultiviramo v mediju z lizogensko juho (LB) z ampicilinom, da dobimo veliko količino bakterij s kloniranim vstavkom gena. Po tem koraku boste imeli veliko ponudbo vašega ojačanega in kodiranega gena. Za izvedbo pregledovanja kloniranega gena uporabimo komercialno dostopen komplet za izolacijo bakterijske plazmidne DNA in očistimo njen gen. Shranjujte v zamrzovalniku, dokler jih ne potrebujete.

Kaj potrebujete

• Komercialno dostopni kompleti za kloniranje
• Reagenti PCR
• Thermocycler (ali stroj PCR / PCR)
• Inkubator
• Laboratorijska oprema in potrebščine
• Ciljni gen za kloniranje